Всего 10 лет назад расшифровка генетической информации одного человека в течение нескольких недель для выявления определенной вызывающей заболевание генетической мутации была бы списана со счетов как научная фантастика.

Это было время проекта "Геном человека", и потребовались армии роботов-секвенировщиков, работавших круглосуточно в течение почти десятилетия, чтобы разгадать полную последовательность генетического кода человека, называемого геномом, путем составления алфавита ДНК буква за буквой.

Теперь команда, возглавляемая Майклом Хаммером из Университета Аризоны, применила секвенирование генома следующего поколения для расшифровки всей ДНК пациента, который умер от внезапной необъяснимой эпилептической смерти.

Они не только нашли вероятного виновника - ранее неизвестную мутацию в гене, кодирующем белок натриевых каналов в центральной нервной системе, - но и их результаты предлагают некоторое эмоциональное облегчение и объяснение семье пациента в отсутствие медицинского диагноза и какой-либо семейной истории подобного заболевания. Исследовательская группа опубликовала свои результаты в мартовском номере Американского журнала генетики человека.

"Если у вас маленький ребенок с тяжелой формой эпилепсии, незнание того, что является ее причиной, является большим бременем для семьи", - сказал Майкл Хаммер, адъюнкт-профессор кафедры экологии и эволюционной биологии UA и научный сотрудник исследовательской лаборатории Аризоны UA. "Это оставляет много открытых вопросов, а иногда даже чувство вины".

Учитывая тяжесть состояния пациентки, отсутствие заболевания у обоих родителей и ее младшего брата или сестры, а также отсутствие эпилепсии в семейном анамнезе, Хаммер и первый автор Кришна Вирама исключили наследственный генетический дефект в качестве причины. Скорее, они подозревали так называемую мутацию de novo, "опечатку" в генетическом алфавите, сгенерированную по чистой случайности, скорее всего, в отцовской зародышевой линии.

"Нам было поручено найти пресловутую иголку в стоге сена", - сказал Вирама, аспирант лаборатории Хаммера. "Чтобы найти мутацию de novo, мы должны прочесать весь геном. В прежние времена мы могли бы составить список генов-кандидатов и секвенировать их по одному гену за раз. К сожалению, это требует много работы, особенно в мозге, где у вас есть тысячи генов, которые потенциально могут быть вовлечены в процесс, ведущий к неврологическому расстройству ".

"Разработка технологии секвенирования следующего поколения в последние годы обеспечивает гораздо более эффективный подход к фактическому анализу всех генов одновременно. Итак, это то, что мы хотели сделать ".

"Мы изучаем уровень всего генома, - добавил Хаммер, - то, что было невозможно до самого недавнего времени".

"Причиной подобного неврологического расстройства может быть мутация в определенном гене; это может быть определенная последовательность, которая была изменена; или это может быть последовательность, которая была удалена или продублирована, изменив количество копий гена".

"У всех нас есть различия в количестве копий определенных генов, но они не обязательно плохие", - объяснил он. "Но иногда это изменение может вызвать заболевание".

"Например, было обнаружено, что некоторый процент ранее необъяснимых нарушений интеллекта связан с геномными перестройками".

В этом случае исследователи не нашли неопровержимого доказательства, рассмотрев вариации числа копий, оставив точечные мутации или небольшие вставки или удаления букв ДНК в качестве вероятной причины.

Используя возможности технологии секвенирования Complete Genomics, Inc., в течение нескольких недель было расшифровано от 96 до 97 процентов последовательности ДНК пациентки, а также геномы ее родителей и родного брата.

Вирама отметил, что каждая из примерно 3 миллиардов пар оснований, составляющих алфавит ДНК человека, была прочитана по меньшей мере 50 раз.

"Это важно, потому что при секвенировании всего генома все еще допускается много ошибок, поэтому вам придется удвоить свои усилия, чтобы добиться необходимой точности".

Оказалось, что последовательности ДНК семьи отклоняются от эталонного генома человека примерно в 5 миллионах мест. Это может показаться многовато, но в свете того факта, что только около 2 процентов последовательности ДНК человека содержат реальные гены, большинство этих вариаций попадают в некодирующие области генетического материала.

На следующем этапе команда Хаммера должна была выяснить, что означают эти вариации. Используя базы данных известных генов, они проверили, какие из них расположены в реальных последовательностях генов, а какие могут изменить аминокислотную последовательность соответствующего белка, который они кодируют. В итоге у них осталось около 13 000 мутаций.

Они надеялись, что где-то в этом пуле кандидатов была та мутация, которая вызвала эпилепсию у девочки и, возможно, привела к ее смерти.

Чтобы сократить количество возможных вариантов, команда затем провела скрининг на мутации, которые, по-видимому, нарушали законы менделевского наследования.

"Мутации De novo будут выглядеть так, как будто они не подчиняются правилам, по которым, как мы знаем, наследуется генетический материал", - объяснил Вирама. "У пациента будет вариант, который не обнаружен у родителей или брата или сестры. Мы нашли 34 сайта, которые соответствуют этой схеме ".

В среднем у одного человека возникает только одна спонтанная мутация в кодирующей области гена. Таким образом, обнаружение 34 показало команде, что большинство этих мутаций, скорее всего, были ошибками в секвенировании.

Вирама сказал: "Десять из них уже были занесены в общедоступные базы данных, что означает, что они встречаются у нормальных людей и не должны вызывать заболевание. Вероятно, это просто систематические артефакты процесса секвенирования, поэтому мы могли бы их устранить ".

Команда расшифровала оставшиеся 24 вариации стандартными методами, и, как и ожидалось, только одна оказалась настоящей мутацией. Вариант, который ранее не был связан с какими-либо нарушениями при эпилепсии у человека, состоял из неправильной буквы в гене, который служит основой для белка, играющего важную роль в том, как нервные клетки взаимодействуют друг с другом.

"Эти каналы выполняют чрезвычайно важные функции, - сказал Вирама, - что иллюстрируется тем фактом, что их структура очень похожа от плодовых мух до рыб, ящериц и людей. Просто взглянув на то, насколько высококонсервативными оставались эти белки на протяжении миллионов лет эволюции, становится совершенно ясно, что обнаруженная нами мутация является особенно разрушительной, которая на самом деле не должна происходить ".

Выявление мутации в критическом компоненте нервной системы у пациента, страдающего тяжелой и иначе необъяснимой эпилепсией, было бы достаточной причиной для прекращения исследования и объявления дела закрытым.

"Мы решили сделать еще один шаг вперед и на самом деле посмотреть, сможем ли мы выяснить точные последствия этой мутации", - сказал Вирама.

С этой целью команда провела электрофизиологические исследования этой конкретной мутации. Исследователи объединились с генетиком Мириам Мейслер из Мичиганского университета, чтобы ввести дефектный ген в культивируемые нервные клетки и изучили, что происходит, когда они подвергают клетки воздействию слабого электрического тока, точно так же, как они испытывают при стимуляции другой нервной клеткой в центральной нервной системе.

"Когда напряжение повышается, происходит внезапное открытие натриевых каналов", - сказал Вирама. "Вскоре после этого они действительно быстро закрываются, и напряжение возвращается к норме. И это, по сути, то, как нормальные нейроны общаются, как электрические сигналы передаются по мозгу и телу ".

"Напротив, мутантные белки канала открылись так быстро, как должны были, но некоторые из них не смогли быстро закрыться, а некоторые вообще не закрылись", - объяснил Вирама. "Все это приводит к неправильному отключению электрического сигнала. Эти изменения предсказывали повышенную возбудимость нейронов и судороги ".

"Суть в том, что мы можем использовать секвенирование всего генома, чтобы найти мутации, которые лежат в основе этих тяжелых случаев эпилепсии, и прямо сейчас вывести это за рамки литературных стандартов, проведя функциональные исследования, чтобы подтвердить, что мы нашли правильную мутацию", - сказал Хаммер.

Лаборатория Хаммера планирует создать диагностический центр, чтобы сделать секвенирование всего генома доступным для клинического сообщества в надежде помочь детям с ранней эпилепсией и другими редкими недиагностированными расстройствами.

"Мы хотим повторить этот эксперимент со многими другими пациентами", - сказал Хаммер. "Мы готовы принимать ДНК от пациентов и проводить такого рода исследования".

Вирама добавил: "Прямо сейчас мы проводим фундаментальное исследование, чтобы идентифицировать все вовлеченные мутации. В конечном итоге цель состоит в разработке лекарств, которые конкретно воздействуют на пораженные пути ".

Хаммер сказал, что при текущей стоимости около 5000 долларов за полностью секвенированный геном или 1000 долларов за секвенирование всех известных человеческих генов новый подход также может оказаться экономически эффективным.

"Регулярные тесты, которые эти пациенты проходили бы в течение своей жизни, значительно перевесили бы стоимость эксперимента по секвенированию всего генома".

Он добавил: "Как только вы узнаете, что вызывает это состояние, вы можете начать получать информацию о лечении. Поиск лекарств, безусловно, находится в долгосрочной перспективе, хотя на данный момент это невозможно. До тех пор семьи страдают, потому что они просто сидят в темноте и гадают. Что-то пошло не так во время беременности? Я сделал что-то, что вызвало расстройство у ребенка? Обнаружение дефектного гена может принести огромное облегчение семье ".